導讀

在科研圈，Western blot（WB）堪稱“實驗玄學”——條帶忽明忽暗、背景臟如馬賽克、分子量對不上……好不容易做出結果，卻因圖片不合格被期刊拒稿？別慌！今天手把手教你從“WB新手”變“條帶達人”，輕松拿捏符合期刊要求的“神仙條帶圖”！ ?

一、實驗設計：避坑第一步

? 你真的懂“對照”嗎？

- 陽性對照（證明體系可行）、陰性對照（排除非特異性結合）、內參對照（校正上樣量）缺一不可！ ?

- 舉例：研究腫瘤蛋白表達，記得同時測癌組織（陽性）、正常組織（陰性）、β-actin內參。 ?

**劃重點**：沒有對照的WB=“自說自話”，期刊編輯秒拒沒商量！?

二、樣本制備：細節控的自我修養

? 蛋白提取3大雷區，千萬別踩！

① 暴力提取=蛋白碎一地

超聲/研磨時控制強度，避免蛋白降解（尤其脆性樣本）。

② 濃度測定擺爛=條帶忽胖忽瘦

用BCA/Bradford法精確測濃度，上樣量誤差≤5%！

③ Loading Buffer沒煮透=高分子量“拖尾”

95℃煮樣5-10分鐘，離心后取上清，別偷懶！ ?

三、電泳與轉膜：承上啟下的“技術活”

? 電泳：選對膠，條帶分分鐘“站隊”

- 小分子蛋白（<20kD）：12%-15% SDS-PAGE膠，跑快一點（電壓≥80V，避免擴散）。 ?

- 大分子蛋白（>100kD）：8%-10%膠，低電壓慢跑，防止“卡膠”。?

? ?轉膜：膜選不對，前功盡棄！

- PVDF膜：疏水強，適合>20kD蛋白，用甲醇活化30秒。 ?

- NC膜：親水好，適合<20kD蛋白，但易脆易漏。?

四、抗體孵育：抗體選對，條帶自帶“高光”

? 抗體避坑指南

- 一抗：認準“驗證過的應用”（比如明確標注“WB適用”，別買“科研盲盒”）。 ?

- 二抗：種屬匹配是底線（小鼠一抗配抗小鼠二抗，HRP/AP標記按需選）。 ?

五、顯色成像：捕捉條帶的“決定性瞬間”

① 成像設備

選擇拍照速度快，信噪比高的設備。

② 曝光策略

先短后長（避免過曝，保留背景灰度值≤25%）。

六、圖片處理：美化≠造假，這3步可做！

? 允許的操作：

- 裁剪白邊（突出條帶區域） ?

- 統一亮度/對比度（全局調整，禁止局部P圖！） ?

- 標注分子量Marker（用箭頭/數字清晰標出） ?

? 絕對禁止：

- 復制粘貼條帶（期刊查重系統能掃出來！） ?

- 抹除背景雜點（真實數據比“完美”更重要）

七、期刊要求：投稿前的“最后安檢”

? 必查清單：

- 分辨率：300dpi及以上（tiff格式優先） ?

- 條帶順序：與實驗描述完全一致（從左到右標清樣本編號） ?

- 圖注規范：包含抗體名稱、稀釋度、內參信息（例：β-actin, 1:1000）?

科研人專屬祝福