多重數字PCR檢測重組腺相關病毒(rAAV)病毒基因組拷貝數的滴度
【導讀】
? ? ? ? ? 艾普拜生物與熙寧（精翰）生物攜手就多重數字PCR檢測重組腺相關病毒(rAAV)病毒基因組拷貝數的滴度開展深度合作，此次強強聯手，利用Naica Crystal digital PCR技術（cdPCR）優化重組腺相關病毒rAAV2和rAAV8的基因組拷貝數定量流程。
【 概況 】
? ? ? ? ? 重組腺相關病毒(rAAV)是基因治療關鍵的病毒載體，該病毒載體開發中主要挑戰來自大規模生產的上游與下游的工藝優化和檢測方案的標準化，其中重組腺相關病毒(rAAV)基因組拷貝數的準確滴定與臨床前和臨床環境中正確給藥劑量直接相關，建立標準、準確和可重復的重組腺相關病毒(rAAV)基因組拷貝數定量的方法是基因治療產品中工藝開發和優化的重要環節。已有報道的，實時熒光定量PCR（qPCR）技術用于重組腺相關病毒(rAAV)基因組拷貝數的滴定檢測存在標準品建立復雜和定量重復性差的問題，數字PCR（dPCR）技術作為一種新型PCR技術，可直接定量重組腺相關病毒(rAAV)基因組拷貝數、無需依賴標準品和標準曲線，對抑制物耐受程度高，尤其適用于未純化的病毒裂解樣品的定量檢測。
Fig1、重組腺相關病毒（rAAV）的生產
(1)將帶有目的基因序列的ITR 側翼表達載體質粒與(2)攜帶rep-cap基因的AAV包裝質粒和
(3)腺病毒輔助質粒共轉染HEK-293細胞時，AAV載體的生產效率與使用腺病毒感染時一致。
【 實驗目的 】
? ? ? ? ? 我們利用Naica Crystal digital PCR技術（cdPCR）對重組腺相關病毒(rAAV)質粒載體和病毒基因組中ITR（CY5標記）、EGFP（GOI，HEX標記）和轉錄相關調控元件WPRE（FAM標記）三個不同基因位點同時拷貝數定量的方法進行優化，在數據分析中對不同病毒樣品的前處理方案的條件進行闡述和比較，發現病毒樣品的前處理方案中ITR發卡結構的線性化和衣殼蛋白的裂解條件對病毒基因組拷貝數定量的精確性影響尤為重要，為數字PCR方法在基因治療病毒載體的質量控制體系中建立標準的檢測方法提供依據。
【 rAAV病毒基因組拷貝數滴度的定量檢測方案 】
Fig1、重組腺相關病毒（rAAV）的生產
? ? ? ? ? 我們針對rAAV病毒載體進行了三重靶基因同時檢測，包括：a. rAAV病毒通用檢測位點ITR基因（CY5標記），b. EGFP（GOI）基因（HEX標記）用于rAAV滴度定量檢測，c. 轉錄相關調控元件WPRE基因（FAM標記），可用于協助EGFP（GOI）基因定量準確性的評估。同時三重靶基因檢測對rAAV質粒載體拷貝數定量、rAAV常用血清型rAAV2和rAAV8的病毒基因組拷貝數定量。
我們選用和元生物（OBiO）生產的rAAV2和rAAV8兩種血清型病毒樣品，在rAAV病毒樣品前處理階段，首先對rAAV2和rAAV8病毒顆粒進行DNase I消化處理，然后使用不同的熱裂解條件對rAAV病毒衣殼蛋白進行裂解，再使用兩種不同的稀釋液對rAAV病毒裂解樣品進行梯度稀釋（Fig1），后續將梯度稀釋的待測樣品加入cdPCR反應體系中，使用cdPCR系統進行拷貝數定量（Fig2）。
由于rAAV病毒末端兩個ITR區域是反向互補序列，會形成發卡狀的二級結構，影響引物和探針的結合，我們選擇使用Msp I限制性內切酶處理。在已報道的檢測方法中，需要在數字PCR反應前對病毒基因組進行酶切預處理。由于cdPCR系統基于Crystal微滴技術即“微晶”微滴技術，允許直接添加限制性內切酶混合于cdPCR反應體系中，經過微滴生成步驟即可完成酶切反應，節省對病毒載體樣品的處理時間。
Fig3、cdPCR系統檢測流程
? ? ? ? ? cdPCR采用創新型微流控設計的2D微滴矩陣技術即Crystal微滴技術作為整個系統的核心技術理念，Opal高通量芯片作為專用的耗材，可單一樣品生成和讀取約20000個微滴數，僅需一步法上樣將PCR預混液加入Opal芯片中即可完成從微滴生成、PCR擴增和三色熒光分析的整個實驗流程，全程僅需2個半小時。結合Crystal miner智能可視化的圖像分析軟件，獲得的置信水平和真實可信的數據結果（Fig3）。
【 結果】
■ cdPCR檢測質粒樣品進行概念驗證
? ? ? ? ? 通過陽性對照質粒標準品進行概念驗證，測試三重引物和探針的使用性能，根據線性化質粒定量檢測的結果顯示，WPRE（Fig4A）和EGFP (Fig4B)陰陽性微滴群的區分度良好，但是ITR(Fig4C) 陰陽性微滴群的區分度不好，存在雨滴現象，可能是受到ITR發卡狀二級結構影響，隨后我們在cdPCR反應體系中加入Msp I限制性內切酶用于切割ITR發卡結構，結果顯示酶切后陰陽性微滴群的區分度得到改善（Fig4D）。經Msp I酶切后ITR拷貝數定量也比酶切前更接近于理論值（Fig5）。
Fig4、cdPCR檢測WPRE/EGFP/ITR 三靶標1D散點圖
? ? ? ? ? A圖顯示WPRE檢測的1D散點圖，B圖顯示EGFP檢測的1D散點圖，C圖顯示Msp I酶切處理前ITR檢測的1D散點圖，D圖顯示Msp I酶切處理后ITR檢測的1D散點圖，藍色表示WPRE陽性微滴群，綠色表示EGFP陽性微滴群，紅色表示ITR陽性微滴群，灰色表示陰性微滴群。
Fig5、Msp I酶切前后ITR基因絕對定量拷貝數值
上圖空心圓圈代表Msp I酶切前的數據；實心方塊代表Msp I酶切后的數據；橫線代表CI at 95%下的平均值mean。
? ? ? ? ? ?接下來對梯度稀釋的線性化質粒樣品進行定量檢測，結果表明cdPCR定量結果和理論值一致性較高，三個靶基因測量R2均接近1（Fig6）。對于4個批次內及批次間樣本檢測結果分析（表1），cdPCR定量數據均表現出良好的重復性，變異系數最大值小于5.46%。
Fig6、cdPCR檢測三個靶標基因測量值和理論值的一致性
A圖顯示WPRE基因；B圖顯示EGFP基因；C圖顯示ITR基因。圖中豎線代表error bar。
表1 cdPCR對4個批次質粒樣品的定量檢測結果的一致性分析
■ cdPCR測試不同稀釋液對病毒滴度的影響
? ? ? ? ? ?分別使用稀釋液A和稀釋液B稀釋處理rAAV2和rAAV8病毒樣品，并進行三梯度線性檢測EGFP（GOI）基因（Fig7），結果顯示兩種稀釋液的定量數據無明顯差異。
Fig7、不同稀釋液對rAAV EGFP基因定量檢測結果的影響
圖中黑色方塊代表稀釋液A，灰色方塊代表稀釋液B，橫線代表CI at 95%下的平均值（n=3）。
■ cdPCR檢測不同的熱裂解時間對rAAV病毒基因組拷貝數定量的影響
? ? ? ? ? 為了探討rAAV病毒衣殼蛋白熱裂解時間對定量結果的影響，分別對rAAV2和rAAV8進行10分鐘和20分鐘熱裂解處理并對定量數據進行比較，實驗結果表明rAAV2和rAAV8兩種病毒在10分鐘和20分鐘的條件下定量數據無顯著差異（Fig8）。
Fig8、分別熱裂解10分鐘和20分鐘對rAAV2和rAAV8病毒基因組拷貝數的定量數據
圖中顯示2和8分別代表rAAV2和rAAV8，其中圓點代表測得濃度，橫線代表均值。
■?rAAV病毒樣品 ITR與EGFP及WPRE的比值
? ? ? ? ? ?ITR是位于rAAV病毒基因組兩側的短DNA 序列，當使用Msp I限制性內切酶切處理后，檢測出的ITR拷貝數和EGFP（GOI）及WPRE基因的比例應該是2:1:1。在10分鐘和20分鐘熱裂解處理后，分別檢測rAAV2和rAAV8病毒樣品的三個濃度梯度，計算ITR/EGFP和ITR/WPRE的比值并進行Bland-Altman一致性分析，實驗數據表明rAAV2病毒樣品處理過程中采用熱裂解10分鐘得到的結果更接近于預期比值，對rAAV8病毒樣品的熱裂解時間20分鐘比值優于10分鐘的比值。兩種病毒之間關鍵基因的比值差異推測可能是由于rAAV血清型差異導致的。
Fig9、Bland-Altamn分析不同熱裂解時間對rAAV2和rAAV8中ITR、EGFP和WPRE定量比率的一致性
? ? ? ? ? 最后對兩種病毒樣品分別進行十倍梯度稀釋檢測（5個數據點，每個數據點重復3次）以驗證cdPCR方法的靈敏度，同時可幫助評估LOQ定量檢測限，結果如下表9所示，兩種rAAV病毒樣品的三個靶基因定量檢測線性R2均接近1，對于低豐度樣品三個靶基因均有檢出。此外對低豐度樣品判定，可以借助Crystal Miner軟件的“Explore Crystal”功能對微滴進行追溯分析，確保結果真實可靠（Fig10）。
表9
：rAAV2和rAAV8梯度稀釋檢測
Fig10、Crystal Miner軟件進行低豐度病毒樣品中陽性微滴進行追溯分析
【 總結 】
? ? ? ? ? cdPCR 進行rAAV病毒基因組拷貝數的定量檢測具有較好的數據重復性和數據一致性，這一點對于rAAV基因組拷貝數定量以及成品的質量控制是至關重要的。此外cdPCR系統具備智能可視化Crystal Miner分析軟件，可以進行數據的質控溯源分析，確保數據的準確性。本次實驗數據基于三熒光通道cdPCR系統在同一反應中檢測三個rAAV病毒樣品中相關靶基因，對于三重數字PCR實驗中各熒光通道之間的串擾現象，能夠通過Crystal Miner分析軟件手動或者自動實現熒光串擾的補償校正，避免因熒光染料發射光譜之間疊加所造成的誤差導致結果的誤判（Fig13）。
Fig13、Crystal Miner軟件進行熒光補償校正
A、熒光補償校正前，Blue通道和Green通道熒光圖譜；B、熒光補償校正調整前，Blue通道1D圖；C、熒光補償校正后，Blue通道和Green通道熒光圖譜；D、熒光補償校正后，Blue通道1D圖。在B和D中灰色代表陰性微滴群體，藍色代表陽性微滴群體。
? ? ? ? ? 最后我們探索出適合rAAV2和rAAV8病毒基因組拷貝數的定量檢測流程（Fig14），本次實驗旨在為基因治療領域的科學家和研究學者提供一個參考依據，用于制定rAAV病毒基因組拷貝數定量檢測的解決方案。
Fig14、rAAV2和rAAV8病毒基因組拷貝數的定量檢測流程
參考文獻
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【關于艾普拜】
? ? ? ? ? 艾普拜生物科技（蘇州）有限公司位于江蘇醫療器械科技產業園，已通過國家高新技術企業，擁有2500平米的生產廠房。艾普拜生物作為臨床分子檢測的解決方案供應商，致力于醫療診斷產品（診斷試劑、儀器）的研發、生產、銷售和服務。公司基于Naica CN數字PCR平臺和自主專利的檢測技術，持續開發以游離DNA作為檢測材料的用于疾病診斷和治療的基因檢測項目和試劑盒，主要應用于與疾病相關分子及細胞遺傳學檢驗、靶向用藥指導的分子診斷檢測等數十種臨床檢測產品，操作簡便、結果迅速、分析簡單，靈敏度高。
? ? ? ? ? 公司在檢測儀器和試劑方面擁有多項核心技術，已獲得國內外專利授權十余項，軟件著作權多項。公司通過ISO9001、ISO13485等認證，具有完備的質量管理體系，繼公司數字PCR系統于2021年3月獲得醫療器械注冊證后，實時熒光PCR分析儀同時獲批醫療器械注冊證。
【關于熙寧】
專業的生物藥生物分析實驗室
? ? ? ? ? 熙寧生物是一家專業的符合國際GLP&GCP質量管理規范的生物藥生物分析實驗室，為國內外生物醫藥公司提供臨床和臨床前大分子生物分析(Bioanalysis，BA) 和伴隨診斷(Companion Diagnostics，CDx) 產品開發服務。
? ? ? ? ? 一站式的生物分析服務包括抗體制備和細胞株構建，樣本采集包及實驗室手冊，符合法規要求的分析方法學的開發和驗證，以及樣本分析。檢測類型涵蓋藥代動力學(PK)，藥效學(PD)，抗藥抗體(ADA)，中和抗體(NAb)，和生物標志物(Biomarker)檢測，包括基于流式細胞術(FACS)和基因檢測平臺(PCR)針對細胞和基因治療藥物的PK, PD分析服務，以及細胞和基因水平的生物標志物檢測、二代測序(NGS)服務。伴隨診斷產品開發服務包括LDT方法學開發、CDx產品開發及驗證、注冊檢驗、臨床試驗研究和注冊申報。
